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目 錄 一、前言 二、合成多肽藥物藥學(xué)研究的基本考慮 三、合成多肽藥物藥學(xué)研究的主要內(nèi)容 (一)制備工藝研究 (二)結(jié)構(gòu)確證研究 (三)制劑處方工藝研究 (四)質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (五)穩(wěn)定性研究 四、名詞解釋 五、參考文獻(xiàn) 六、著者 合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 一、前言 多肽類化合物是一類重要的生物活性分子。20世紀(jì)70年代生物技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，使多肽等生物技術(shù)藥物的研究進(jìn)展迅速;與此同時，隨著多肽固相合成技術(shù)及高效液相色譜(HPLC)純化、分析技術(shù)等的發(fā)展，合成多肽藥物的開發(fā)也成為藥物研究中的一個活躍領(lǐng)域。 采用化學(xué)合成方法制備多肽，可以對天然多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而增加多肽與受體的親和力、選擇性，增強(qiáng)對酶降解的抵抗力或改善藥代動力學(xué)特性，甚至由受體的激動劑變?yōu)檗卓箘?此外，新技術(shù)的發(fā)展，例如以多肽固相合成和組合化學(xué)為基礎(chǔ)的組合肽庫合成技術(shù)，使得在短時間內(nèi)獲得大量的多肽化合物成為可能，藥物篩選的效率不斷提高。因此，將會有越來越多的采用化學(xué)合成方法制備的多肽類化合物成為治療用藥物。 合成多肽藥物是指采用化學(xué)合成方法制備的多肽類藥物。這類藥物的藥學(xué)研究同樣遵循國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)發(fā)布的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸(包括天然氨基酸和非天然氨基酸)構(gòu)成，這使得多肽類藥物在制備方法、結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量研究等方面又有與一般藥物不同的獨(dú)特問題。本指導(dǎo)原則就是在已有的相關(guān)指導(dǎo)原則基礎(chǔ)上，對合成多肽藥物藥學(xué)研究方面所涉及的特殊問題進(jìn)行分析，結(jié)合國內(nèi)對多肽藥物研究和評價的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出多肽藥物藥學(xué)各項(xiàng)研究的一般性要求。當(dāng)然，具體品種研究的內(nèi)容與深度還要取決于品種本身的特性。 本指導(dǎo)原則適用于采用液相或固相合成方法制備的多肽藥物。 二、合成多肽藥物藥學(xué)研究的基本考慮 合成多肽藥物藥學(xué)研究的主要內(nèi)容、研究思路、研究方法及一般性的技術(shù)要求與其他類型的化學(xué)藥物基本一致。但是，由于多肽藥物的特點(diǎn)，在進(jìn)行藥學(xué)研究時還應(yīng)注意考慮以下問題。 1、關(guān)于多肽(原料藥)合成工藝選擇的考慮 多肽的化學(xué)合成是有機(jī)合成的一個非常特殊的分支，目前主要有液相合成和固相合成兩種方法。 液相合成是經(jīng)典的多肽合成方法，一般采用逐步合成或片段縮合方法。逐步合成法通常從鏈的C'末端氨基酸開始，向不斷增加的氨基酸組分中反復(fù)添加單個α-氨基保護(hù)的氨基酸。片段縮合一般先將目標(biāo)序列合理分割為片段，再逐步合成各個片段，最后按序列要求將各個片段進(jìn)行縮合。液相合成的優(yōu)點(diǎn)是每步中間產(chǎn)物都可以純化、可以獲得中間產(chǎn)物的理化常數(shù)、可以隨意進(jìn)行非氨基酸修飾、可以避免氨基酸缺失，缺點(diǎn)是較為費(fèi)時、費(fèi)力等。 固相合成是將目標(biāo)肽的第一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固相載體(樹脂)相連,再以這一氨基酸的氨基為合成起點(diǎn),使其與相鄰氨基酸(氨基保護(hù))的羧基發(fā)生酰化反應(yīng),形成肽鍵。然后讓包含有這兩個氨基酸的樹脂肽的氨基脫保護(hù)后與下一個氨基酸的羧基反應(yīng),不斷重復(fù)這一過程,直至目標(biāo)肽形成為止。其優(yōu)點(diǎn)是簡化了每步反應(yīng)的后處理操作，避免因手工操作和物料轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失，產(chǎn)率較高且能夠?qū)崿F(xiàn)自動化等;其缺點(diǎn)是每步中間產(chǎn)物不可以純化，必須采用較大的氨基酸過量投料，粗品純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段進(jìn)行純化等。 液相合成和固相合成各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)合成的實(shí)際需要選擇適合的工藝。一般而言，液相合成法較適于合成短肽;固相合成法更適于合成中、長肽。當(dāng)然，也可以將兩種方法結(jié)合應(yīng)用，比如采用液相方法合成短肽片斷，然后將該片斷應(yīng)用到固相合成中。 無論是液相合成還是固相合成,均是按照設(shè)計的氨基酸順序,通過定向形成酰胺鍵方法得到目標(biāo)分子。從理論上講這并不復(fù)雜,但實(shí)施起來需要考慮的因素還是比較多。簡單的羧酸與胺之間形成酰胺鍵,一般是先將羧基轉(zhuǎn)變成一個活潑的羧基衍生物(如酰氯或酸酐)再與胺作用,或者在反應(yīng)體系中加入縮合劑。但是，氨基酸之間形成酰胺鍵情況則復(fù)雜得多,這是由于每一個氨基酸既含有氨基,同時又含有羧基。如果將一種氨基酸的羧基活化,則其可以和同一種或另一種氨基酸分子的氨基反應(yīng);如果將幾種氨基酸混合在一起,加入縮合劑,則只能得到由具有多種不同氨基酸順序的多肽組成的混合物。因此，多肽合成的研究中不僅需要關(guān)注活化方法、偶聯(lián)方法等，更要關(guān)注保護(hù)/脫保護(hù)策略的選擇。 在多肽合成過程中，會產(chǎn)生一些與目標(biāo)肽結(jié)構(gòu)類似的雜肽，例如因氨基酸消旋化產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體、因部分氨基酸未連接上產(chǎn)生的缺失肽、因肽鍵斷裂產(chǎn)生的斷裂肽等。因此，需要考慮選擇可靠的分離和純化方法使多肽的純度達(dá)到要求。多肽藥物的純化通常采用色譜方法，但在一些情況下，有機(jī)合成中常見的純化方法(例如重結(jié)晶)也可能適用。 2、關(guān)于多肽結(jié)構(gòu)確證研究的考慮 鑒于多肽分子主要是由各種氨基酸構(gòu)成，單純運(yùn)用有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)研究常用的一些方法例如紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等來解析多肽的結(jié)構(gòu)可能有一定的困難;一般而言，氨基酸組成分析、質(zhì)譜、氨基酸序列測定等對其結(jié)構(gòu)確證有重要意義。 氨基酸組成分析可說明多肽的組成是否正確;質(zhì)譜可以提供分子量以及序列信息。上述兩項(xiàng)數(shù)據(jù)除用于證明多肽的結(jié)構(gòu)外，還能在一定程度上反映測試樣品的純度(是否含有合成雜質(zhì))。氨基酸序列測定可以直觀地說明氨基酸的連接順序是否正確，對于說明合成多肽的結(jié)構(gòu)尤其是中、長肽的結(jié)構(gòu)有非常重要的價值。 在進(jìn)行多肽藥物的結(jié)構(gòu)研究時，應(yīng)注意結(jié)合多肽的合成工藝(包括中間體的結(jié)構(gòu)研究)、多肽的分子大小(包括組成多肽的氨基酸數(shù)量和種類)、擬解決的結(jié)構(gòu)問題、各種測試方法所能提供的結(jié)構(gòu)信息等，綜合考慮選用合適的研究方法。 對于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽，應(yīng)進(jìn)行必要的立體化學(xué)研究。 3、關(guān)于多肽制劑處方工藝研究的考慮 合成多肽藥物制劑研究的總體目標(biāo)和要求與其它類型化學(xué)藥物制劑是一致的，即通過一系列研究工作，保證制劑劑型選擇依據(jù)充分、處方合理、工藝穩(wěn)定、生產(chǎn)過程得到有效控制，并能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。 但是，由于多肽藥物的生物活性可能和其空間結(jié)構(gòu)相關(guān)，多肽分子中存在大量的酰胺鍵，另外還可能有羧基、羥基、氨基、巰基等較為活潑的基團(tuán)，較易水解或降解，因此了解合成多肽藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性對選擇適宜的劑型和合理的處方、制備工藝有重要作用。 4、關(guān)于多肽藥物質(zhì)量研究的考慮 多肽藥物(包括原料藥和制劑)的質(zhì)量研究的主要項(xiàng)目、相關(guān)檢測方法建立和驗(yàn)證的要求與其它類型化學(xué)藥物基本一致。 但是，多肽藥物的一些特點(diǎn)在質(zhì)量研究中需要給予充分的考慮，在研究時需要增加一些特別的考察項(xiàng)目，例如氨基酸組成分析等;對于一些中、長肽，生物特性例如效價、免疫原性和抗原活性等也有必要進(jìn)行研究。 此外，由于合成工藝、結(jié)構(gòu)等方面的獨(dú)特性，合成多肽藥物在部分質(zhì)控項(xiàng)目的檢測方法建立和方法學(xué)驗(yàn)證方面也有一些特殊的考慮。例如，合成多肽原料藥中工藝雜質(zhì)的來源和一般化學(xué)藥物有所不同，其可能的工藝雜質(zhì)如:缺失(不完全)肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護(hù)所形成的副產(chǎn)物、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物、非對映異構(gòu)的多肽、低聚物和/或聚合物及合成中所用的毒性試劑和溶劑等。在合成多肽藥物的有關(guān)物質(zhì)檢查方法的研究中需要充分考慮這些可能的工藝雜質(zhì)，對這些工藝雜質(zhì)檢出能力的驗(yàn)證是方法學(xué)驗(yàn)證的重要方面。 5、關(guān)于多肽藥物穩(wěn)定性研究的考慮 由于多肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這類藥物的穩(wěn)定性相對較差，引起多肽藥物不穩(wěn)定的原因主要有水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、β消除、凝聚、沉淀、吸附等。穩(wěn)定性研究應(yīng)根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點(diǎn)合理選擇試驗(yàn)條件、考察項(xiàng)目。 三、合成多肽藥物藥學(xué)研究的主要內(nèi)容 合成多肽藥物的藥學(xué)研究內(nèi)容和一般化學(xué)藥物一樣，主要包括原料藥的制備工藝研究和結(jié)構(gòu)確證研究、制劑的處方工藝研究、質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂、穩(wěn)定性研究等。這些研究內(nèi)容的一般性的技術(shù)要求也和一般化學(xué)藥物基本一致。但是，正如前面所討論的，多肽藥物還有一些特殊的方面需要在研究中予以考慮，以下主要是針對多肽藥物藥學(xué)研究的特殊內(nèi)容及其技術(shù)要求進(jìn)行討論，這些技術(shù)要求也包括了對申報資料內(nèi)容的一些要求。 (一)原料藥制備工藝研究 1、工藝選擇 研究者可以根據(jù)目標(biāo)肽的結(jié)構(gòu)、自身生產(chǎn)條件等考慮選用液相合成或固相合成工藝。但無論采用何種合成工藝，均需要提供化學(xué)反應(yīng)式、工藝流程圖、操作過程等，對工藝參數(shù)(如投料量、反應(yīng)條件、反應(yīng)試劑)要有詳細(xì)的描述，包括對于多肽的修飾(例如二硫鍵的形成等)。 2、起始原料、試劑的質(zhì)量控制 (1) 氨基酸及其衍生物 氨基酸及其衍生物作為多肽合成的起始原料，其質(zhì)量對合成多肽的質(zhì)量有重要影響，因此應(yīng)關(guān)注氨基酸及其衍生物的來源、質(zhì)控方法等。對于起始原料的質(zhì)量控制應(yīng)足以保證其質(zhì)量的一致性，以最終保證合成的多肽批間質(zhì)量的穩(wěn)定。作為起始原料的氨基酸及其衍生物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般應(yīng)包括性狀、熔點(diǎn)、比旋度、化學(xué)純度、色譜純度及光學(xué)純度、含量等，其中對于起始原料的化學(xué)純度和光學(xué)純度的控制尤為重要。 如果使用了特殊的氨基酸或其衍生物，例如經(jīng)過復(fù)雜修飾的非天然氨基酸、采用新工藝合成的氨基酸等，申報資料中還應(yīng)提供其合成工藝及結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)資料。 (2) 樹脂 采用固相合成方法制備多肽，應(yīng)提供樹脂的來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)報告，并對樹脂的摩爾取代系數(shù)、在不同溶劑中的膨脹系數(shù)、所用合成條件下的穩(wěn)定性情況、交聯(lián)度等予以說明。 常用樹脂包括聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺和聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物等，應(yīng)根據(jù)目標(biāo)多肽C末端氨基酸的不同類型(如羧酸型、酰胺型等)選擇特定用途的樹脂，并說明選擇的依據(jù)。 (3) 試劑和溶劑 可以參考《化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的基本要求。 3、工藝的過程控制 (1)反應(yīng)終點(diǎn)監(jiān)控 液相合成屬于常規(guī)有機(jī)合成，一般可采用色譜法(如TLC法、HPLC法)監(jiān)測;固相合成偶合反應(yīng)的終點(diǎn)可采用茚三酮法、三硝基苯磺酸(TNBS)法和四氯苯醌等監(jiān)測。二硫鍵連接的終點(diǎn)可用Ellman試驗(yàn)或HPLC法監(jiān)測。除上述方法外，其他合適的方法也可以使用。 (2)中間體質(zhì)量控制 對于液相合成，應(yīng)參照《化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》對中間體的質(zhì)量進(jìn)行控制，特別要對縮合片段制訂合適的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(例如對比旋度、熔點(diǎn)和純度等進(jìn)行控制)，含有較長序列的中間體還應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究(例如氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、質(zhì)譜、比旋度等)。 對于固相合成，一般無中間體分離過程。但如果多肽從樹脂上切割后還需進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，對中間體的質(zhì)量也要進(jìn)行相應(yīng)控制，同時還要進(jìn)行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)研究。 4、分離和純化 在多肽合成過程中，會產(chǎn)生一些與目標(biāo)多肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似的雜肽，例如缺失肽、非對映異構(gòu)體等，隨著肽鏈的增長，可能存在的雜肽數(shù)量也隨之增加。因此，應(yīng)研究合適的純化方法將目標(biāo)肽從雜肽中分離出來。 多肽純化方法的選擇需要綜合考慮多肽和雜肽的肽鏈長短、極性和荷電性、粗品的純度等。可用于多肽純化的方法包括重結(jié)晶、逆流分布、電泳、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、反相色譜等。目前已上市多肽藥物常見的純化方法是采用凝膠柱脫鹽后，再用制備型高效液相色譜進(jìn)行純化。 對于選定的純化方法，應(yīng)提供詳細(xì)的驗(yàn)證性資料例如純化前后樣品的代表性色譜圖以說明純化效果。同時應(yīng)提供詳細(xì)的純化過程和相關(guān)的工藝參數(shù)。純化工藝的研究可結(jié)合質(zhì)量研究中雜質(zhì)分析方法的驗(yàn)證進(jìn)行。 純化后樣品的干燥方法也應(yīng)明確。常用的干燥方法為凍干法，如果多肽對溫度不敏感，也可采用室溫或高溫干燥。 (二)結(jié)構(gòu)確證研究 多肽結(jié)構(gòu)研究的主要目的是要說明其氨基酸組成和序列是否正確。多肽分子中如有半胱氨酸，應(yīng)明確其狀態(tài)(氧化態(tài)或還原態(tài))，對含有多個半胱氨酸的多肽，應(yīng)明確二硫鍵的正確連接位點(diǎn)。對于某些長肽，可能還需要采用核磁共振、園二色譜等方法對其空間結(jié)構(gòu)(例如二級、三級結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。 對于短肽，采用元素分析、紅外光譜、核磁共振譜、氨基酸組成分析、質(zhì)譜等常見方法，有時就足以說明其結(jié)構(gòu)特征。如果上述測試取得的信息難以進(jìn)行合理解析和歸屬，應(yīng)進(jìn)行氨基酸序列測定。 對于中、長肽應(yīng)進(jìn)行氨基酸組成和氨基酸序列分析。闡明氨基酸序列的通用方法是Edman降解，這種方法是測定N端氨基酸的一種化學(xué)方法;基于多種技術(shù)的質(zhì)譜，如快原子轟擊、電噴霧、場解析和激光解析質(zhì)譜，可提供多肽的分子量及其序列信息，是對Edman降解的很好補(bǔ)充。 中、長肽的結(jié)構(gòu)研究中，盡管紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等能夠提供的可供分析的信息有限，但在一些情況下，上述研究還應(yīng)考慮進(jìn)行。例如，在可獲得結(jié)構(gòu)確證對照品時，進(jìn)行上述譜圖的對比測定，對于說明所研制產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)有重要意義;對于全新結(jié)構(gòu)的多肽，進(jìn)行上述研究，也可為說明多肽結(jié)構(gòu)提供輔助信息，并為質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供信息。 對于含有20個以上氨基酸殘基的多肽，如不能直接確定其序列，可根據(jù)多肽分子量大小及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶(一般為肽鏈內(nèi)切酶)將多肽裂解成小片段，再分析各小片段的序列。 當(dāng)多肽中含有非天然氨基酸及氨基酸衍生物時，結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)予以證明。此時，應(yīng)在相應(yīng)的研究中，考察這些非天然氨基酸及氨基酸衍生物的色譜行為。 (三)制劑處方工藝研究 了解合成多肽的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性對選擇適宜的劑型和合理的處方、制備工藝有重要作用。在進(jìn)行多肽藥物的制劑處方工藝研究時，了解原料藥的色澤、pH、pI、比旋度、立體化學(xué)、水分、溶解度、油/水分配系數(shù)、溶劑化或水合狀態(tài)等，特別是原料藥在固態(tài)和/或溶液狀態(tài)下(不同pH)在光、熱、濕、氧等條件下穩(wěn)定性情況等信息是十分必要的。另外，多肽藥物的空間結(jié)構(gòu)與生物活性密切相關(guān)，任何導(dǎo)致多肽折疊結(jié)構(gòu)解體或松散以及損害立體結(jié)構(gòu)的因素都會影響其生物活性，在處方工藝研究時對這些因素需要有全面的了解。 1、劑型的選擇 對于全新結(jié)構(gòu)多肽藥物的劑型開發(fā)，或者對已上市多肽制劑改變劑型時，全面研究并分析藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性對于選擇合適的劑型是十分重要的。 與其他化學(xué)藥物相比，合成多肽藥物多具有以下特點(diǎn)：(1)穩(wěn)定性差,包括存在化學(xué)和構(gòu)象不穩(wěn)定性;(2)易被胃腸道中的蛋白質(zhì)水解酶降解;(3)體內(nèi)生物半衰期短，被快速消除或降解;(4)脂溶性差，不易通過生物屏障等。因此，多肽藥物通常選擇注射途徑給藥，主要劑型為凍干粉針劑和注射液。對于研究結(jié)果顯示藥物在溶液狀態(tài)下不穩(wěn)定的，不宜選擇注射液等液體劑型。 對于需頻繁注射給藥的合成多肽藥物，存在患者使用不便、順應(yīng)性差等問題，選擇適宜的非注射給藥途徑也是此類制劑的研究熱點(diǎn)，目前研究最多的主要有鼻腔給藥、肺部給藥、經(jīng)皮給藥和口服給藥等。同時，為了減少給藥次數(shù)，也可考慮采用緩釋或控釋技術(shù)，使藥物在給藥部位緩慢釋放，達(dá)到理想的治療效應(yīng)。 2、處方篩選及工藝研究 合成多肽藥物處方篩選及工藝研究的重點(diǎn)是通過選擇適宜的處方和工藝條件，保證藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性。 處方篩選通常通過選擇適宜的輔料提高制劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性。通過前期的研究工作，詳細(xì)了解外界條件(如pH、溫度、光照、氧濃度等)對多肽穩(wěn)定性的影響，已基本可以確定引起某一多肽藥物不穩(wěn)定的主要因素。在處方設(shè)計中，通過使用適宜的輔料來提高多肽藥物制劑的穩(wěn)定性是目前的主要方法，盡管使用添加劑可以提高多肽藥物穩(wěn)定性的機(jī)制還不十分清楚。對于多肽藥物的二級或三級結(jié)構(gòu)可能對藥物生物活性產(chǎn)生直接影響的，選擇適宜的輔料可能會保證藥物空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。研究中首先需注意多肽藥物和輔料相容性的考察，可參照《化學(xué)藥物制劑研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上，處方篩選可通過設(shè)計相應(yīng)的試驗(yàn)進(jìn)行，重點(diǎn)考察不同處方下藥物的有關(guān)物質(zhì)變化和活性的改變。例如，對于制劑pH變化可能引起多肽凝聚沉淀，使藥物變性失去生物活性的，可以考察不同pH值的系列處方，或添加不同穩(wěn)定劑(如抗氧劑)的處方，在不同條件下降解產(chǎn)物和活性等的變化情況。 多肽藥物生產(chǎn)過程可能會對其穩(wěn)定性和制劑質(zhì)量產(chǎn)生影響，這些因素包括pH、熱處理環(huán)節(jié)、凍干環(huán)節(jié)和剪切力、壓力等，需注意對影響多肽藥物穩(wěn)定性的生產(chǎn)過程因素進(jìn)行深入的研究。由于多肽藥物特殊的理化性質(zhì)，無菌制劑一般不采用終產(chǎn)品熱壓滅菌的生產(chǎn)工藝，多數(shù)情況下采用膜過濾的無菌生產(chǎn)工藝。 對制劑基本項(xiàng)目考察合格的樣品，可選擇兩種以上處方樣品進(jìn)行影響因素試驗(yàn)，重點(diǎn)考察藥物物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性，篩選出相對滿意的處方。同時，制劑處方和制備工藝也需根據(jù)后期臨床試驗(yàn)的需求和臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。 (四)質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1、質(zhì)量研究 (1) 原料藥的質(zhì)量研究 合成多肽原料藥的質(zhì)量研究除參考一般化學(xué)藥物的研究思路進(jìn)行常規(guī)項(xiàng)目的研究外，還應(yīng)根據(jù)合成多肽的結(jié)構(gòu)特征、制備工藝特點(diǎn)和生物學(xué)特點(diǎn)等進(jìn)行針對性的研究，研究項(xiàng)目一般包括：外觀性狀、理化常數(shù)、鑒別、氨基酸組成分析、水分、反離子含量、純度、有機(jī)溶劑和反應(yīng)試劑殘留量、生物學(xué)安全性檢查、含量和/或活性效價測定等。檢測方法研究和驗(yàn)證的基本思路和要求與已頒布的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則相一致。 對于合成多肽藥物，除常規(guī)項(xiàng)目外，理化常數(shù)一般需要關(guān)注其比旋度、等電點(diǎn)(pI)、溶解性(主要為水和緩沖液中)等。 一般而言，多肽藥物的常規(guī)檢查項(xiàng)目與其它化學(xué)藥物相同。此外，與多肽藥物的結(jié)構(gòu)及合成特點(diǎn)相關(guān)的一些檢查項(xiàng)目，例如氨基酸組成分析、反離子(例如三氟醋酸或醋酸根)含量、反應(yīng)試劑殘留量(例如從樹脂上裂解多肽使用了氫氟酸，需要檢查氟化物殘留量)等，則需要在原料藥質(zhì)量研究中予以重視。 相關(guān)肽檢查(或稱有關(guān)物質(zhì)檢查)是反映多肽化學(xué)純度的重要指標(biāo)之一，根據(jù)多肽的理化性質(zhì)、分子大小，可選擇合適的色譜、電泳等方法進(jìn)行。短肽可參考一般化學(xué)藥品有關(guān)物質(zhì)檢查的研究思路選用適宜的方法;長肽的有關(guān)物質(zhì)檢查方法除常見的RP-HPLC外，還可考慮使用高效離子交換色譜(HPIEC)、毛細(xì)管電泳技術(shù)等，非解離條件下的高效分子排阻色譜(HPSEC)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)以及激光散射粒度測定等技術(shù)可用于聚合體/低聚體的檢查。有關(guān)物質(zhì)檢查的方法學(xué)驗(yàn)證應(yīng)能證明所采用的方法可以有效分離目標(biāo)多肽與工藝雜質(zhì)(例如缺失肽等)、降解產(chǎn)物(例如二硫鍵交換或氧化產(chǎn)物等)、聚合物等。一般應(yīng)考察兩種以上不同原理的方法，高效液相色譜法至少應(yīng)包括一種梯度洗脫方法，并采用多肽粗品和強(qiáng)制降解試驗(yàn)等對方法的專屬性等進(jìn)行考察、對比，此外還應(yīng)注意研究多波長檢測的結(jié)果并選擇合適的檢測波長等。 合成多肽因結(jié)構(gòu)特征不同于通常的小分子化學(xué)藥品，純度檢查有時難以從根本上有效控制產(chǎn)品安全性，需要進(jìn)行必要的生物學(xué)安全性檢查(如過敏試驗(yàn)、降壓物質(zhì)、升壓物質(zhì)、異常毒性等)以全面控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證安全性。此外，根據(jù)產(chǎn)品具體情況，對于長肽，有時尚需進(jìn)行免疫原性或抗原活性等生物特性的研究。 含量測定是評價多肽質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，理化方法測定其含量時稱為“含量測定”，生物學(xué)方法或酶化學(xué)方法測定其效價時稱為“效價測定”。對于短肽，理化方法測得的含量可以反映其有效程度時，首選簡單、通用的含量測定方法;對于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽，需進(jìn)行生物學(xué)方法或酶化學(xué)方法測定藥物活性(效價)的研究，包括含量與活性的關(guān)系、相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證等。 (2)制劑的質(zhì)量研究 合成多肽制劑的質(zhì)量研究基本思路和要求可參照《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程指導(dǎo)原則》、《化學(xué)藥物制劑研究指導(dǎo)原則》等相關(guān)內(nèi)容，根據(jù)合成多肽的具體特點(diǎn)，在原料藥質(zhì)量研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合劑型特點(diǎn)、處方工藝以及臨床使用特點(diǎn)，重點(diǎn)研究所用輔料和制劑工藝對產(chǎn)品質(zhì)量的影響、制劑輔料和制劑產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對檢測方法的影響以及與劑型相關(guān)的質(zhì)量要素。研究項(xiàng)目一般亦應(yīng)包括性狀、鑒別、檢查(安全性、均一性、純度要求與有效性指標(biāo)等)、含量或效價測定等幾個方面。 2、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 合成多肽藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則、要求與《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程指導(dǎo)原則》是一致的。即，在系統(tǒng)的質(zhì)量控制研究基礎(chǔ)上，充分考慮藥品安全、有效、質(zhì)量可控的要求，以及生產(chǎn)、流通和使用等環(huán)節(jié)的影響，確定能夠揭示、控制藥物內(nèi)在品質(zhì)的檢測項(xiàng)目、分析方法和限度要求，如原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括氨基酸組成、等電點(diǎn)、中長肽的肽圖等。合理可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量以保證臨床用藥的安全性和有效性，并有效地控制藥品批間質(zhì)量的一致性。相關(guān)質(zhì)控項(xiàng)目的限度確定也應(yīng)參考相關(guān)的指導(dǎo)原則，例如對于有關(guān)物質(zhì)檢查限度的確定可以參考《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、已有國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的品種同時還可參考《已有國家標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等的原則性要求，并結(jié)合產(chǎn)品本身的特性及臨床使用情況，視具體情況而定。 隨著藥物研發(fā)進(jìn)程的深入，研究數(shù)據(jù)積累的不斷豐富、方法學(xué)研究的完善和藥物研究技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在不同研究階段需要不斷修訂和完善。 (五)穩(wěn)定性研究 合成多肽藥物穩(wěn)定性研究的基本原則應(yīng)遵循《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》的一般性要求。 與一般化學(xué)藥物相比，多肽藥物的穩(wěn)定性較差。引起多肽藥物不穩(wěn)定的原因主要有水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、β消除、凝聚、沉淀、吸附等。當(dāng)多肽處于溶液中或高濕下保存時，其降解或聚合的速度會比干燥條件下大為增加。因此，穩(wěn)定性研究應(yīng)根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點(diǎn)合理選擇試驗(yàn)條件、考察項(xiàng)目。加速試驗(yàn)和長期留樣試驗(yàn)的試驗(yàn)條件應(yīng)依據(jù)藥物對溫度、濕度和光照等條件的敏感程度考察(影響因素試驗(yàn))基礎(chǔ)上選擇;考察項(xiàng)目除常規(guī)項(xiàng)目(例如原料藥的比旋度、有關(guān)物質(zhì)和含量等)外，根據(jù)具體情況，可能還需要考察其生物活性的變化。 與其他化學(xué)藥物不同，多肽藥物可能具有一定程度的表面活性，有與直接接觸藥品的包裝材料和容器發(fā)生吸附等相互作用的可能，從而引起制劑效價、生物活性下降。例如有些多肽分子能夠與玻璃表面的硅醇基發(fā)生相互作用。因此，在包裝材料的選擇方面需注意其與多肽藥物相互作用的研究，有些情況下可選擇特殊處理后的包裝容器，如表面經(jīng)硅烷化處理的容器等。 四、名詞解釋 非天然氨基酸：除自然界生物體中存在的氨基酸外，其它由人工合成制備的氨基酸。 反離子：和多肽形成離子對的帶有相反電荷的離子。 五、參考文獻(xiàn) 1.Guidance for Industry for the Submission of Chemistry，Manufacturing，and Controls Information for Synthetic Peptide Substances，F(xiàn)DA，1994。 2.合成多肽專題研討會會議紀(jì)要，藥品審評中心，2001。 3.多肽藥物分析方法研究進(jìn)展，葉曉霞，俞雄，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2003，34(7)。 六、著者 《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組 |
